προσπαθούσε να σκληραγωγηθεί μέσω του αθλητισμού. Σε ηλικία εννέα ετών παρουσίασε βαριά επιπλοκή στο άσθμα που τον ταλαιπωρούσε και διαπιστώθηκε «σπαστικός βήχας».

Εξαιτίας της κατάστασης της υγείας του, δεν φοίτησε κανονικά στο σχολείο. Αρχικά, έμαθε να γράφει και να διαβάζει από την μητέρα του, ενώ αργότερα φοίτησε στο δημόσιο σχολείο, ολοκληρώνοντας κανονικά μόνο τη δεύτερη και τρίτη τάξη, παρακολουθώντας τα μαθήματα των υπόλοιπων τάξεων όταν του επέτρεπε η υγεία του και μελετώντας κυρίως στο σπίτι.

Στην παιδική του παρέα υπήρχαν παιδιά από διάφορα κοινωνικά στρώματα της περιοχής. Ήδη τότε φανερώθηκε το χάρισμα και η κοινωνικότητα του Γκεβάρα, χαρίσματα τα οποία καλλιεργούσαν συνεχώς οι γονείς του. Ήταν πλέον καθημερινό το φαινόμενο να μπαινοβγαίνουν τα παιδιά της γειτονιάς και της περιοχής συνεχώς στο σπίτι των γονέων του.

O Γκεβάρα ήταν παράλληλα σοβαρό και εσωστρεφές αγόρι, το οποίο από νωρίς άρχισε να ενδιαφέρεται για τη λογοτεχνία. Κατά την περίοδο της εφηβείας του, έδειξε ιδιαίτερο ενδιαφέρον για την ποίηση και ειδικότερα για το έργο του Πάμπλο Νερούδα, ενώ συγχρόνως έγραφε και ο ίδιος ποιήματα σε όλη τη διάρκεια της ζωής του. Τα λογοτεχνικά του ενδιαφέροντα εκτείνονταν από αρχαία ελληνική φιλοσοφία (Πολιτεία του Πλάτωνα, Αριστοτέλη) και ευρωπαϊκή λογοτεχνία (Σαίξπηρ, Γκαίτε) μέχρι κλασικά έργα του Τζακ Λόντον ή του Ιουλίου Βερν και πραγματείες του Σίγκμουντ Φρόυντ και του Μπέρτραντ Ράσελ. Σύμφωνα με τον πατέρα του, «όταν έγινε δώδεκα χρονών κατείχε μία παιδεία που αναλογούσε σε έναν νέο δεκαοκτώ ετών, ενώ η βιβλιοθήκη του ήταν γεμάτη από κάθε είδους βιβλία περιπέτειας και ταξιδιωτικά μυθιστορήματα».Σε μεγαλύτερη ηλικία, ανέπτυξε επίσης ενδιαφέρον για τη φωτογραφία.

To 1942 εγγράφηκε στο δημόσιο λύκειο Ντεάν Φούνες της Κόρδοβα. Οι σχολικοί του βαθμοί υπήρξαν πολύ καλοί στη λογοτεχνία, την ιστορία και τη φιλοσοφία, αλλά και πολύ κακοί στην αγγλική γλώσσα, τα μαθηματικά και τη φυσική ιστορία. Την ίδια περίοδο ξεκίνησε να συντάσσει ένα είδος φιλοσοφικού λεξικού, καταγράφοντας τα αναγνώσματά του ή κρατώντας σημειώσεις σχετικά με αυτά. Μετά την ολοκλήρωση των σπουδών του στο λύκειο, αποφάσισε να συνεχίσει τις σπουδές του στον τομέα της εφαρμοσμένης μηχανικής. Γράφτηκε στη Σχολή Εφαρμοσμένης Μηχανικής του πανεπιστημίου του Μπουένος Άιρες και για ένα διάστημα εργάστηκε στην κατασκευή δημοσίων έργων, κυρίως σε μικρές πόλεις. Η ασθένεια της γιαγιάς του, Άνας, η οποία είχε υποστεί εγκεφαλική αιμορραγία και κατόπιν ημιπληγία, τον ανάγκασε να εγκαταλείψει την εργασία του προκειμένου να την φροντίσει κατά τις τελευταίες μέρες της ζωής της. Τόσο η δική της κατάσταση, που οδήγησε στο θάνατό της, όσο και η προσωπική του εμπειρία με το άσθμα τον επηρέασαν βαθιά, και πιθανώς συνέβαλαν στην απόφαση του να ασχοληθεί τελικά με την ιατρική.

Το 1948 γράφτηκε στην ιατρική σχολή του πανεπιστημίου του Μπουένος Άιρες, όπου ολοκλήρωσε τις σπουδές του το 1953, χωρίς όμως να ακολουθήσει την κλινική πρακτική που απαιτούταν προκειμένου να είναι σε θέση να εξασκήσει το επάγγελμα του γιατρού. Κατά τη διάρκεια των σπουδών του, στα τέλη του 1950, εξασφάλισε άδεια ώστε να εργαστεί ως νοσοκόμος σε εμπορικά πλοία του αργεντινού στόλου.

Μετά την αποφοίτησή του από την ιατρική σχολή του πανεπιστημίου του Μπουένος Άιρες, ο Γκεβάρα ταξίδεψε στη Γουατεμάλα, με ενδιάμεσους σταθμούς τη Βολιβία, το Περού, τον Παναμά, την Κόστα Ρίκα, τη Νικαράγουα και το Ελ Σαλβαδόρ. Εκεί γνώρισε την Περουβιανή οικονομολόγο Ίλδα Γκαδέα, η οποία εργαζόταν στην κρατική υπηρεσία του Ινστιτούτου Προώθησης της Παραγωγής.

Η Γκαδέα ήταν εξόριστη εξαιτίας της συμμετοχής της στη Λαϊκή Επαναστατική Αμερικανική Συμμαχία (American Popular Revolutionary Alliance, APRA) του Περού, και διέθετε γνωριμίες με πολιτικά πρόσωπα. Με τη βοήθειά της, ο Γκεβάρα ήρθε σε επαφή με ένα ευρύ κύκλο εξόριστων και αριστερών διανοουμένων. Κατά το δεύτερο μήνα της παραμονής του στη χώρα, και ενώ η πολιτική της κατάσταση εντεινόταν λόγω των μεταρρυθμίσεων του φιλελεύθερου λαϊκού καθεστώτος του προέδρου Χακόμπο Άλμπενς (Jacobo Albenz Guzmán), ο Γκεβάρα πραγματοποίησε τις πρώτες του επαφές με πολιτικούς της κυβέρνησης.

Στις 15 Φεβρουαρίου του 1954 ανέφερε σε επιστολή του προς τη θεία του πως είχε λάβει οριστικά θέση υπέρ της κυβέρνησης της Γουατεμάλας, επιλέγοντας το κομμουνιστικό Εργατικό Κόμμα (Partido Guatemalteco de Trabajo) και σχετιζόμενος με άλλους αριστερούς διανοούμενους. Στα τέλη του ίδιου μήνα, κατέγραψε επίσης την πολύ κακή οικονομική του κατάσταση.

Για ένα σύντομο διάστημα, ο Γκεβάρα εγκατέλειψε τη Γουατεμάλα και μετέβη στο Ελ Σαλβαδόρ, προκειμένου να ανανεώσει τη βίζα παραμονής του. Λίγο μετά την επιστροφή του, επιχειρήθηκε από τη CIA ένοπλη δράση, με επικεφαλής το συνταγματάρχη Κάρλος Καστίγιο Άρμας, για την ανατροπή της κυβέρνησης του Άρμπενς και με αφορμή την άφιξη ενός πλοίου με όπλα από την Τσεχοσλοβακία.

Ο Γκεβάρα συμμετείχε στην ένοπλη πολιτοφυλακή της κομμουνιστικής νεολαίας που αντιστάθηκε, αλλά παρά τη διάθεσή του να αγωνιστεί στο μέτωπο, κατετάγη τελικά ως γιατρός. Στις 27 Ιουνίου, ο Άρμπενς ανακοίνωσε την παραίτησή του και αναζήτησε άσυλο στη μεξικανική πρεσβεία. Ο Γκεβάρα, επίσης καταζητούμενος του νέου καθεστώτος, αναζήτησε άσυλο στην πρεσβεία της Αργεντινής κατόπιν προτροπής του φίλου του, Σάντσες Τοράνσο. Οι πολιτικές εξελίξεις στη Γουατεμάλα σημάδεψαν βαθιά τον Γκεβάρα και η εμπειρία που αποκόμισε στη χώρα χαρακτηρίζεται ως σημείο πολιτικής καμπής για τον ίδιο.

Προκειμένου να συντηρείται οικονομικά, εργάστηκε ως γιατρός και ως φωτογράφος, εν μέσω πολλαπλών επαγγελματικών κρίσεων και οικονομικών προβλημάτων που αντιμετώπισε κατά διαστήματα. Το καλοκαίρι του 1955, ήρθε σε επαφή με τον αδελφό του Φιδέλ Κάστρο, Ραούλ, από τον οποίο πληροφορήθηκε την επικείμενη άφιξη του Κάστρο στο Μεξικό. Στις αρχές Ιουλίου του 1955, o Γκεβάρα συνάντησε για πρώτη φορά τον Φιδέλ Κάστρο, o οποίος ήταν αρχηγός των "Moνκαντίστας", και είχε καταφύγει στο Μεξικό μετά την αποφυλάκισή του, αποτέλεσμα της χάρης που του δόθηκε από τον Μπατίστα. Την πρώτη συνάντησή τους ακολούθησαν πολυάριθμες συναντήσεις και συζητήσεις γύρω από την πολιτική κατάσταση στη Λατινική Αμερική και το ενδεχόμενο της οργάνωσης μίας επανάστασης ενάντια στη δικτατορία του Μπατίστα.

Την ίδια περίπου περίοδο, η Γκαδέα του ανακοίνωσε πως ήταν έγκυος και ο Γκεβάρα της πρότεινε γάμο, ο οποίος τελέστηκε τελικά στις 18 Αυγούστου 1955, στο ληξιαρχείο του μεξικανικού χωριού Τεποτσοτλάν.

Πεπεισμένος πως ο Κάστρο είχε τις προϋποθέσεις να αποτελέσει ένα χαρισματικό ηγέτη της κουβανικής επανάστασης,ο Γκεβάρα συμμετείχε στο κίνημα της 26ης Ιουλίου (ισπ. Movimiento 26 de Julio, M-26-7), με στόχο την ένοπλη δράση για την ανατροπή του κουβανικού καθεστώτος. Ο Γκεβάρα συμφώνησε να τους συνοδεύσει με την ιδιότητα του γιατρού, ωστόσο έλαβε κανονικά μέρος στην στρατιωτική εκπαίδευση των ανταρτών, το βασικό στάδιο της οποίας ξεκίνησε στις αρχές του 1956, υπό τις οδηγίες του Μεξικανού παλαιστή Αρσάνιο Βαγένας σε ζητήματα εκγύμνασης και αυτοάμυνας, καθώς και του πρώην συνταγματάρχη του Ισπανικού Δημοκρατικού Στρατού, Αλπέρτο Μπάγιο.

Στα απομνημονεύματα του Μπάγιο, πληροφορούμαστε πως ο Γκεβάρα επέδειξε μεγάλη θέληση κατά τη διάρκεια της εκπαίδευσης, αποτελώντας τον καλύτερο μαθητή του. Την ίδια περίοδο, θεωρείται πιθανό πως απέκτησε το παρωνύμιο Τσε (Che), εξαιτίας της συχνής χρήσης της λέξης che (φίλος ή και επιφώνημα: Ε εσύ!) που έκανε ο ίδιος μιλώντας, έκφραση που αν και είχε εισαχθεί στη γλώσσα των Αργεντινών, φαινόταν αστεία στους Κουβανούς.

Στις 25 Νοεμβρίου του 1956, 82 επαναστάτες, μεταξύ αυτών και ο Τσε Γκεβάρα, ταξίδεψαν με το πλοιάριο Granma, από τον ποταμό Τούξπαν του Mεξικoύ με προορισμό την Κούβα, στην οποία έφθασαν τελικά στις 2 Δεκεμβρίου. Κατά την απόβασή τους, δέχθηκαν επίθεση από τα στρατεύματα του καθεστώτος, από την οποία επέζησαν 15-20 αντάρτες που κατάφεραν να ανασυνταχθούν και να καταφύγουν στα βουνά της Σιέρρα Μαέστρα. Με σημείο εκκίνησης την επίθεση αυτή, ο ρόλος του Τσε Γκεβάρα στον ανταρτοπόλεμο διαφοροποιήθηκε σταδιακά, αντιλαμβανόμενος o ίδιος όλο και λιγότερο ως μοναδικό καθήκον του την ιατρική συμπαράσταση, και λαμβάνοντας ενεργό μέρος στις ένοπλες δραστηριότητες τον επαναστατών.

Η αποφασιστικότητά του και οι ικανότητες του, σύντομα οδήγησαν στην άνοδό του στην ιεραρχία του αντάρτικου σώματος, κερδίζοντας το σεβασμό των υπολοίπων ανταρτών, χωρίς να απουσιάζει και το αίσθημα του φόβου που προκαλούσε ενίοτε η σκληρότητά του, υπεύθυνος ο ίδιος για εκτελέσεις ανταρτών που λειτουργούσαν ως πληροφοριοδότες του κουβανικού καθεστώτος.

Υπήρξε ο πρώτος αντάρτης, στον οποίο δόθηκε το αξίωμα του Κομαντάντε του Επαναστατικού Στρατού της Κούβας, στις 21 Ιουλίου 1957. Αν και μέχρι τότε αποτελούσε έναν απλό οπλίτη, χωρίς να έχει διακριθεί ιδιαιτέρως σε στρατιωτικό επίπεδο αλλά έχοντας επιδείξει γενναιότητα και αρχηγικές δεξιότητες, ο Κάστρο του εμπιστεύτηκε την ηγεσία της Δεύτερης Φάλαγγας του αντάρτικου στρατού (για λόγους παραλλαγής έφερε τον αριθμό 4), έχοντας έτσι μόνο τον Κομαντάντε εν Σέφε Φιδέλ Κάστρο ως ανώτερό του.

Η μεγαλύτερη ίσως στρατιωτική επιτυχία του Τσε Γκεβάρα υπήρξε η κατάκτηση της Σάντα Κλάρα στις 29 Δεκεμβρίου 1958, μία καθοριστική στιγμή στην ιστορία της κουβανικής επανάστασης. Είχαν προηγηθεί δύο χρόνια ανταρτοπολέμου στην Σιέρρα Μαέστρα εναντίον του πολύ μεγαλύτερου στρατού του Μπατίστα, o οποίος δεχόταν και την υποστήριξη των Ηνωμένων Πολιτειών. Με την κατάκτηση της Σάντα Κλάρα, ο δρόμος για την πρωτεύουσα Αβάνα ήταν πλέον ελεύθερος και την 1η Ιανουαρίου του 1959, ο δικτάτορας Μπατίστα εγκατέλειψε την Κούβα, με προορισμό την Δομινικανή Δημοκρατία. Την μάχη στη Σάντα Κλάρα ακολούθησαν και άλλες σημαντικές πολεμικές συγκρούσεις, πριν την τελική επικράτηση των ανταρτών.

Μετά την επιτυχία του αντάρτικου στρατού και κατά τους πρώτους μήνες της κατάληψης της εξουσίας, ο Τσε Γκεβάρα τέθηκε διοικητής του φρουρίου Λα Καμπάνια, με αρμοδιότητα να εξετάζει τις εφέσεις των υποθέσεων των δύο Επαναστατικών Δικαστηρίων (Tribunales Revolucionarios, TR) που λειτουργούσαν δικάζοντας στρατιωτικούς και αστυνομικούς ή πολίτες. Στις 7 Φεβρουαρίου 1959, ψηφίστηκε ένα διάταγμα μέσω του οποίου αποκτούσαν την κουβανική υπηκοότητα όλοι οι αλλοδαποί διοικητές του αντάρτικου στρατού. Ο νόμος αυτός, επρόκειτο εμφανώς να εφαρμοστεί αποκλειστικά στην περίπτωση του Τσε Γκεβάρα, αποτελώντας ένα είδος φόρου τιμής και αναγνώρισης στο πρόσωπό του και τη συμβολή του στην κουβανική επανάσταση.

Μαζί με τους Φιδέλ Κάστρο, Ραούλ Κάστρο και Καμίλο Σιενφουέγος, αποτέλεσε μετά την επανάσταση σημαντικό μέλος της νέας κουβανικής κυβέρνησης, η οποία σύντομα ξεκίνησε να πραγματοποιεί ριζικές μεταρρυθμίσεις, καθιερώνοντας για παράδειγμα δωρεάν σύστημα υγείας, όπως και ένα εκπαιδευτικό σύστημα που εξασφάλιζε και στα κατώτερα κοινωνικά στρώματα (μέχρι τότε κυρίως αναλφάβητα) σχολική μόρφωση.

Στην κυβέρνηση, ο Γκεβάρα υποστήριξε περισσότερο τις κομμουνιστικές ιδέες απ' όσο ο Φιδέλ Κάστρο. Αν και ήταν ένθερμος υποστηρικτής μίας ριζικής αγροτικής μεταρρύθμισης στη χώρα, χαρακτήρισε τον πρώτο σχετικό νόμο της κυβέρνησης ως μετριοπαθή, «που δεν αποτολμούσε να υπεισέλθει στα ουσιαστικότερα ζητήματα, όπως ήταν η κατάργηση της μεγάλης γαιοκτησίας». Στις 7 Οκτωβρίου, ο Κάστρο του ανέθεσε την αρχηγία του Τομέα Βιομηχανίας του Εθνικού Ινστιτούτου της Αγροτικής Μεταρρύθμισης (Insituto Nacional de la Reforma Agragia, INRA), ρόλος που προστέθηκε στα καθήκοντά του ως διοικητής της Λα Καμπάνια αλλά και αρχηγός του Τμήματος Εκπαίδευσης των Ενόπλων Δυνάμεων. Για να ανταποκριθεί στις ανάγκες του έργου του, ο Γκεβάρα απευθύνθηκε στον οικονομολόγο Σαλβαδόρ Βιλασέκα, ξεκινώντας μαζί του μία σειρά από μαθήματα ανώτερων μαθηματικών.

Στην ακμή της πολιτικής του δραστηριότητας ως μέλος της κυβέρνησης, ο Τσε διορίστηκε διευθυντής της Εθνικής Τράπεζας της Κούβας, στις 26 Νοεμβρίου 1959, διατηρώντας παράλληλα την ευθύνη για το τμήμα βιομηχανίας του INRA και την πολιτιστική επιμόρφωση του στρατού. Ανάμεσα στις πρώτες του ενέργειες, ήταν μία σειρά μέτρων με στόχο τον έλεγχο του αποθέματος συναλλάγματος, καθώς και η ρευστοποίηση των τραπεζών του καθεστώτος του Μπατίστα. Στα τέλη του έτους, και ενώ οι τράπεζες των Ηνωμένων Πολιτειών είχαν ήδη αναστείλει τις πιστώσεις των εισαγωγών, άρχισε να διερευνά, σε συνεργασία με τον Φιδέλ Κάστρο και άλλους κομμουνιστές ηγέτες, το ενδεχόμενο της σοβιετικής στήριξης. Το Φεβρουάριο του 1960, υποδέχθηκε τον Αναστάς Μικογιάν, μέλος του πολιτικού γραφείου του κομμουνιστικού κόμματος της Σοβιετικής Ένωσης και ένθερμο υποστηρικτή της προσέγγισης με την Κούβα, όπως άλλωστε ήταν αρχικά και ο ίδιος ο Τσε.

Το επόμενο διάστημα, εντάθηκε η αντιπαράθεση μεταξύ των Ηνωμένων Πολιτειών και της κουβανικής κυβέρνησης, ενώ στις 13 Οκτωβρίου κηρύχθηκε εμπάργκο σε όλα τα εμπορεύματα με προορισμό την Κούβα, αποκλείοντας τη χώρα από κάθε οικονομική δραστηριότητα. Μία εβδομάδα αργότερα, ο Τσε Γκεβάρα σχολίασε τον αποκλεισμό, αναφερόμενος σε ελλείψεις που δεν θα ήταν δυνατό να καλυφθούν, αλλά και εκφράζοντας αισιοδοξία για την πορεία της κρατικοποιημένης πλέον βιομηχανίας. Παράλληλα, έκανε γνωστό πως δεν ήταν πλέον πρόεδρος της τράπεζας, αναλαμβάνοντας νέα καθήκοντα.

Στα τέλη Οκτωβρίου του 1960, συμμετείχε ως επικεφαλής μίας διπλωματικής αποστολής, με στόχο την εξασφάλιση της στήριξης του σοβιετικού μπλοκ, με τις κύριες διαπραγματεύσεις να πραγματοποιούνται στη Σοβιετική Ένωση. Συναντήθηκε με τον Χρουστσόφ στη Μόσχα ενώ αργότερα επισκέφτηκε το Πεκίνο όπου συνάντησε τον Μάο Τσετούνγκ και έγινε γενικά θερμά δεκτός. H περιοδεία του περιλάμβανε ακόμα την Κορέα και τη Λαϊκή Δημοκρατία της Γερμανίας. H αποστολή εξασφάλισε τελικά ευνοϊκές συμφωνίες, για την εξαγωγή τεσσάρων εκατομμυρίων τόνων ζάχαρης, σε τιμή υψηλότερη από εκείνη της παγκόσμιας αγοράς, εξασφαλίζοντας παράλληλα τον εφοδιασμό της Κούβας με πετρέλαιο και αγορές βιομηχανικών μονάδων με ευέλικτες πιστώσεις.

Στις 23 Φεβρουαρίου 1961 διορίστηκε υπουργός του νεοσύστατου Υπουργείου Βιομηχανίας της Κούβας, σκοπός του οποίου ήταν η οργάνωση των πολυάριθμων βιομηχανικών μονάδων που είχαν αποκτηθεί, καθώς και των κρατικοποιημένων επιχειρήσεων που υπάγονταν στο Τμήμα Βιομηχανίας του INRA.

Τον Απρίλιο του 1961, κατά τη διάρκεια της αμερικανικής εισβολής του Κόλπου των Χοίρων, ο Τσε Γκεβάρα τέθηκε επικεφαλής των κουβανικών στρατευμάτων που θα υπερασπίζονταν την επαρχία Πινάρ ντελ Ρίο, όπου σύμφωνα με ενδείξεις των μυστικών υπηρεσιών, αναμενόταν η πρώτη επίθεση. Χάρη στην αποτελεσματική αντίδραση της κουβανικής αεροπορίας και την αντίσταση της πολιτοφυλακής, η αμερικανική εισβολή απέτυχε, ενώ το στράτευμα του Γκεβάρα παρέμεινε σε αμυντική διάταξη και ανενεργό, καθώς η συγκέντρωση αμερικανικών ναυτικών δυνάμεων κοντά στο Πινάρ ντελ Ρίο αποτέλεσε τελικά προσπάθεια αντιπερισπασμού.

Συνεχίζοντας το έργο του ως υπουργός βιομηχανίας, επεδίωξε να προωθήσει την ταχεία εκβιομηχάνιση της χώρας, πρόγραμμα που υπήρξε όμως πρόωρο, αντιμετωπίζοντας πολλές δυσκολίες στην εφαρμογή του και καταλήγοντας σε αποτυχία. Τον Αύγουστο του 1961 συμμετείχε στις συνεδριάσεις της ολομέλειας του Διαμερικανικού Οικονομικού και Κοινωνικού Συμβουλίου, καταψηφίζοντας το δεκαετές σχέδιο του Τζον Φ. Κένεντι «Συμμαχία για την Πρόοδο» (Alliance for Progress), το οποίο χαρακτήριζε ως μία προσπάθεια αναχαίτισης των επαναστατικών κινημάτων στη Λατινική Αμερική και κατασκεύασμα κατά της Κούβας.

Την ίδια περίπου περίοδο, διαδραμάτισε ενεργό ρόλο στην απόφαση εγκατάστασης σοβιετικών πυραύλων στο έδαφος της Κούβας, γεγονός που δεν πέρασε απαρατήρητο από τις μυστικές υπηρεσίες των Ηνωμένων Πολιτειών, οδηγώντας τελικά στην Κρίση των πυραύλων, τον Οκτώβριο του 1962.

Σε ότι αφορά την οικονομική πολιτική, ο Τσε Γκεβάρα ήταν αντίθετος στην αντιγραφή του σοβιετικού οικονομικού μοντέλου της «οικονομικής αυτοδιαχείρισης», καθώς θεωρούσε πως οι ιδιαίτερες συνθήκες της Κούβας απαιτούσαν διαφορετικές πρακτικές και υπερασπιζόταν το συγκεντρωτισμό στον τομέα της βιομηχανίας.

Στις 11 Δεκεμβρίου του 1964 εκπροσώπησε την Κούβα στη Συνδιάσκεψη του Οργανισμού Ηνωμένων Εθνών.Στην ομιλία του ξεχωρίζει η έντονη διαμαρτυρία του ενάντια στην πολιτική των Ηνωμένων Πολιτειών και τις λατινοαμερικανικές δικτατορίες, η συμπαράταξή του στο θέμα του πυρηνικού αφοπλισμού και το ειρηνευτικό σχέδιο που προτείνει για την Καραϊβική. Λίγες ημέρες αργότερα, ξεκίνησε μία τρίμηνη διεθνή περιοδεία, κατά την οποία επισκέφτηκε την Αλγερία, την Κίνα, τη Γκάνα, τη Γουινέα, το Μάλι, το Κονγκό, την Τανζανία, με μικρές στάσεις στο Παρίσι, την Ιρλανδία και την Πράγα. Στις 24 Φεβρουαρίου, έλαβε μέρος στη διάσκεψη του δεύτερου Οικονομικού Σεμιναρίου Αφροασιατικής Αλληλεγγύης, πραγματοποιώντας την τελευταία δημόσια παρουσία στο διεθνές προσκήνιο. Η ομιλία του προκάλεσε αρκετές εντάσεις στο σοβιετικό μπλοκ, δηλώνοντας πως οι σοσιαλιστικές χώρες όφειλαν να επωμιστούν το κόστος των εθνικοαπελευθερωτικών αγώνων, ενώ θεωρείται πιθανό πως προκάλεσε επίσης ρήξη στη σχέση του με τον Κάστρο, αν και δεν υπάρχει καμία σχετική αναφορά στα απομνημονεύματα του ίδιου του Γκεβάρα. Τον Μάρτιο του 1964, επέστρεψε στην Αβάνα.

Οι διαφορές του με τον Κάστρο σε ό,τι αφορά τις σχέσεις της Κούβας με την Σοβιετική Ένωση ή την οικονομική πολιτική πιθανώς συνέβαλαν στην απόφαση του Τσε να εγκαταλείψει την Κούβα, σκοπεύοντας να μεταφέρει την επανάσταση σε όλον τον κόσμο.Την 1η Απριλίου συνέταξε το αποχαιρετιστήριο γράμμα του προς τον Φιδέλ Κάστρο.

Μετά από μία σύντομη παραμονή στην Αβάνα, ο Γκεβάρα εγκαταστάθηκε στην Βολιβία και ειδικότερα στην ορεινή περιοχή Νιανκαουασού (Ñancahuazú), όπου επρόκειτο να οργανωθεί ο πυρήνας του αντάρτικου στρατού, του οποίου τα μέλη είχαν εκπαιδευτεί νωρίτερα στην Κούβα. Ο Τσε κατέγραψε τα βιώματά του εκείνο το διάστημα, στον ελεύθερο χρόνο που διέθετε, κρατώντας τις σημειώσεις που αργότερα εκδόθηκαν σε βιβλίο. Οι συγκρούσεις με τον βολιβιανό στρατό ήταν τακτικές. O Τσε Γκεβάρα και οι αντάρτες του δεν κατάφεραν να προσελκύσουν τους φτωχούς Βολιβιανούς αγρότες και η προσπάθειά του να φέρει την επανάσταση και στην Βολιβία κατέληξε σε αποτυχία.

Ένας σημαντικός λόγος για την αποτυχία αυτή ήταν το γεγονός ότι το Κομμουνιστικό Κόμμα της Βολιβίας δεν τον υποστήριξε στην προσπάθειά του. Επιπλέον, ιδιαίτερης σημασίας υπήρξε και η ενίσχυση του βολιβιανού στρατού από τις Ηνωμένες Πολιτείες.

Στις 8 Οκτωβρίου, η ομάδα των ανταρτών καθοδηγούμενη από τον Τσε Γκεβάρα, περικυκλώθηκε. Κατά τη διάρκεια της τελικής μάχης, στην περιοχή του φαραγγιού του Τσούρο, η ομάδα αναγκάστηκε να διασκορπιστεί και ο Γκεβάρα τραυματίστηκε στη δεξιά κνήμη, ενώ συγχρόνως το όπλο του αχρηστεύτηκε από έναν πυροβολισμό. Τελικά συνελήφθη και αργότερα μεταφέρθηκε στον πλησιέστερο οικισμό Λα Ιγκέρα. Την καταδίωξη του Τσε Γκεβάρα στη Βολιβία παρακολουθούσε επίσης η CIA, με επικεφαλής τον πράκτορα Φέλιξ Ροδρίγκες (Félix Rodríguez), ο οποίος μετέφερε την πληροφορία της σύλληψής του στο αρχηγείο της υπηρεσίας του και σύντομα μετέβη ο ίδιος στη Λα Ιγκέρα.

Μετά από μερικές ανακρίσεις στο σχολείο του χωριού, ο αιχμάλωτος Γκεβάρα δολοφονήθηκε, στις 9 Οκτωβρίου 1967, από τον υπαξιωματικό του βολιβιανού στρατού Μάριο Τεράν (Mario Terán). Ο συγκεκριμένος αρχικά δίστασε να εκτελέσει την εντολή για τη δολοφονία του αλλά τελικά πυροβόλησε τον αιχμάλωτο, ο οποίος φέρεται να του είπε «Ήρθατε να με σκοτώσετε. Ρίξε, δειλέ, έναν άντρα θα σκοτώσεις». Ο θάνατός του σημειώθηκε λίγο μετά τη 1:00 το μεσημέρι. Στην Κούβα, ο Φιδέλ Κάστρο κράτησε αρχικά επιφυλακτική στάση απέναντι στην είδηση του θανάτου του, ωστόσο στις 15 Οκτωβρίου, αποδέχτηκε το γεγονός, μετά από την εμφάνιση φωτογραφικών αποδείξεων.

Το πτώμα του Γκεβάρα μεταφέρθηκε στο νοσοκομείο Σαν Χοσέ ντε Μάλτα όπου έγινε και νεκροψία, στο πρακτικό της οποίας καταγράφτηκαν συνολικά εννέα πληγές που είχαν προκληθεί από σφαίρες. Σύμφωνα με τη νεκροψία, ο θάνατός του προκλήθηκε από τα τραύματα που έφερε στο θώρακα και την αιμορραγία. Το πτώμα του έπρεπε για τους στρατιωτικούς να χαθεί δίχως κανένα ίχνος και θάφτηκε κρυφά κοντά στο αεροδρόμιο, 30 χλμ. από την Λα Ιγκέρα. Νωρίτερα, στο νοσοκομείο, είχαν κοπεί τα χέρια του, τα οποία διατηρήθηκαν σε φορμόλη προκειμένου να γίνει αργότερα η οριστική αναγνώρισή του. Το πτώμα του έμεινε στον μυστικό του τάφο μέχρι που ανακαλύφθηκε στις 12 Ιουλίου 1997 στο Βαγιεγκράντε της Βολιβίας. Αφού μεταφέρθηκε στην Κούβα, κηδεύτηκε στη Σάντα Κλάρα, την πόλη που ο ίδιος είχε κατακτήσει το 1958 ανοίγοντας το δρόμο για την τελική νίκη του Κάστρο.

Ανάμεσα στα αντικείμενα του Τσε Γκεβάρα που διέθεταν ιδιαίτερο ενδιαφέρον για τους διώκτες του, ανήκε και το ημερολόγιό του, στο οποίο καταγράφονταν τα γεγονότα που σχετίζονταν με τη δράση του αντάρτικου σώματος στο έδαφος της Βολιβίας. Η πρώτη καταχώρηση σε αυτό έγινε στις 7 Νοεμβρίου του 1966, λίγο καιρό μετά την εγκατάσταση του Τσε Γκεβάρα στην περιοχή Νιανκαουασού, ενώ η τελευταία καταγραφή σημειώθηκε στις 7 Οκτωβρίου 1967, μία ημέρα πριν την σύλληψή του. Στο ημερολόγιο αναφέρεται πώς οι αντάρτες αναγκάστηκαν να προβούν σε επιχειρήσεις πρόωρα, εξαιτίας της ανακάλυψής τους από τον βολιβιανό στρατό, όπως και οι λόγοι για τους οποίος ο Γκεβάρα αποφάσισε να διαχωριστεί η φάλαγγα σε δύο μονάδες, χωρίς να καταφέρουν έκτοτε να έρθουν σε επαφή, περιγράφοντας συνολικά τα αίτια της αποτυχίας του αντάρτικου στρατού.

Το ημερολόγιο τυπώθηκε μετά από ελέγχους της γνησιότητάς του, στις 22 Ιουνίου 1968 στην Κούβα. Η διανομή του έγινε δωρεάν και συγχρόνως δημοσιεύτηκε σε άλλα έντυπα ανά τον κόσμο.