στην παράσταση Page Miss Glory, που είχε σχετική επιτυχία και στο Yellow Jack, που αποτέλεσε το πρώτο του θεατρικό δράμα.
Στο μεταξύ ο Φόντα μετά την επιτυχία του The Farmer Takes A Wife, αναχώρησε για το Χόλιγουντ, όπου υπέγραψε συμβόλαιο με την Fox. Παράλληλα ο Στιούαρτ που εκείνη την περίοδο εμφανιζόταν στο Divided by Three κέρδισε τις εντυπώσεις ενός ανιχνευτή ταλέντων της εταιρίας παραγωγής Metro. Πέρασε από οντισιόν με επιτυχία και υπέγραψε επταετές συμβόλαιο με τη Metro.
Τα πρώτα χρόνια της θητείας του στην MGM, ήταν δύσκολο να βρεθεί το κατάλληλο υλικό για εκείνον, η σεμνή του εμφάνιση αποτελούσε εμπόδιο.
Η επιτυχία έφτασε όμως το 1936, μετά από μια σειρά αποτυχημένων ταινιών, όταν η Μάργκαρετ Σάλιβαν τον ζήτησε για συμπρωταγωνιστή της στην ταινία Next time we love. Η Σάλιβαν ασχολήθηκε εντατικά με την προετοιμασία του Στιούαρτ, ο οποίος με τη βοήθεια της απέκτησε αυτοπεποίθηση και κατάφερε να αντεπεξέλθει με επιτυχία στις απαιτήσεις του ρόλου. Μετά την επιτυχία ακολούθησαν δεύτεροι ρόλοι στις ταινίες Σύζυγος εναντίον δακτυλογράφου (Wife vs. secretary, 1936), Χαμένο όνειρο (The Gorgeous Hussy, 1936), Ο χορός είναι η ζωή μου (Born To Dance, 1936) και Η εκδίκηση του γκάνγκστερ (The last gangster, 1937), ενώ η γνωριμία του με τον ατζέντη Λίλαντ Χέιγουορντ, του άλλαξε τη ζωή. Ο Χέιγουορντ κατάλαβε ότι για να γίνει ο Στιούαρτ πρώτο όνομα, θα έπρεπε να κάνει επιτυχία σε ταινία παραγωγής άλλης εταιρίας.
Έτσι το 1938 τον δάνεισαν στην Columbia όπου συμμετείχε στην ταινία του Φρανκ Κάπρα Δε θα τα πάρεις μαζί σου (You Can't Take It With You).

Ο Φρανκ Κάπρα είχε ενθουσιαστεί από την ερμηνεία του Στιούαρτ στο μιούζικαλ του 1937 Οι τρεις δόκιμοι Navy Blue & Gold κι αποφάσισε να του αναθέσει τον πρωταγωνιστικό ρόλο στην ταινία Δε θα τα πάρεις μαζί σου (You Can't Take It With You) με συμπρωταγωνιστές την Τζιν Άρθουρ κι τον Λάιονελ Μπάριμορ. Το Δε θα τα πάρεις μαζί σου έμελλε να γίνει η μεγαλύτερη επιτυχία του 1938 κατακτώντας εκτός των άλλων και το όσκαρ καλύτερης ταινίας την ίδια χρονιά.
Ο Στιούαρτ είχε πλέον εδραιώσει τη θέση του ανάμεσα στους πρωταγωνιστές του Χόλιγουντ.
Παράλληλα με την επιτυχία στον επαγγελματικό τομέα απέκτησε και επιτυχία στον ερωτικό τομέα εφόσον σύναψε σύντομες σχέσεις με την Τζίντζερ Ρότζερς και τη Νόρμα Σίρερ. Η επιτυχία συνεχίστηκε και το 1939, καθώς ανέλαβε να αντικαταστήσει τον Γκάρι Κούπερ σε μια από τις γνωστότερες πλέον ταινίες του Φρανκ Κάπρα, στο Ο κύριος Σμιθ πηγαίνει στην Ουάσινγκτον. Οι κριτικές ήταν διθυραμβικές και ο Στιούαρτ έλαβε την πρώτη του υποψηφιότητα για όσκαρ Α' ανδρικού ρόλου, για το οποίο θεωρήθηκε φαβορί.
Είχε να αντιμετωπίσει όμως άλλες θρυλικές ερμηνείες όπως εκείνη του Κλαρκ Γκέιμπλ για το Όσα παίρνει ο άνεμος (Gone With The Wind) κι εκείνη του Λόρενς Ολίβιε για το Ανεμοδαρμένα ύψη (Wuthering Heights). Νικητής παρόλα αυτά αναδείχτηκε ο Ρόμπερτ Ντόνατ για το Αντίο, Ωραία Νιάτα (Goodbye Mr. Chips). Ο Στιούαρτ έμελλε να συνεργαστεί ακόμη μια φορά με τον Κάπρα το 1946 για την ταινία Μια υπέροχη ζωή (It's A Wonderful Life).
Χρόνια αργότερα ο Κάπρα τον αποκάλεσε τον Καλύτερο ηθοποιό που εμφανίστηκε ποτέ στη μεγάλη οθόνη.
Παρά την επιτυχία του οι θρησκόληπτοι γονείς του τον παρακαλούσαν να τα παρατήσει και να επιλέξει ένα άλλο είδος ζωής.Ο Στιούαρτ συνέχισε να γυρίζει τη μια ταινία μετά την άλλη και κατά τη διάρκεια του 1940. Εκείνη την χρονιά συνεργάστηκε με το σκηνοθέτη Τζορτζ Κιούκορ, την Κάθριν Χέπμπορν και τον Κάρι Γκραντ στην κινηματογραφική μεταφορά του θεατρικού Κοινωνικά σκάνδαλα (The Philadelphia Story). Η επιτυχία του φιλμ του απέφερε μια ακόμα υποψηφιότητα για όσκαρ Α' ανδρικού ρόλου, παρά το γεγονός ότι ο Γκραντ ήταν ο πραγματικός πρωταγωνιστής της ταινίας. Ο ίδιος ο Στιούαρτ δεν πίστευε στη νίκη του και ψήφισε για τη νίκη του φίλου του Χένρι Φόντα, που ήταν υποψήφιος για την κινηματογραφική μεταφορά του μυθιστορήματος του Τζον Στάινμπεκ Τα σταφύλια της οργής (The Grapes Of Wrath).
Η έκπληξη ήταν μεγάλη για εκείνον όταν τελικά αναδείχτηκε νικητής τη βραδιά της απονομής.
Λίγο καιρό μετά τη νίκη του στα Όσκαρ ο Στιούαρτ αναχώρησε εθελοντικά για το μέτωπο. O Β' Παγκόσμιος Πόλεμος ήταν πλέον γεγονός για την ανθρωπότητα.

Το ενδιαφέρον του Στιούαρτ για τα αεροσκάφη τον είχε ωθήσει να βγάλει δίπλωμα πιλότου το 1935 κι όταν ξέσπασε ο πόλεμος στην Ευρώπη αποφάσισε να καταταχθεί στο σώμα της αεροπορίας, όπου κι ολοκλήρωσε την εκπαίδευσή του.
Κατά τη διάρκεια του πολέμου έλαβε μέρος σε πολλές επιχειρήσεις και το 1944 τιμήθηκε με το Σταυρό πολεμικής ανδραγαθίας.

Μετά τον πόλεμο ο Τζέιμς Στιούαρτ αποφάσισε να μην ανανεώσει το συμβόλαιό του με την MGM και να ξεκινήσει μια ανεξάρτητη καριέρα. Είχε επίσης σκεφτεί το ενδεχόμενο να στραφεί στην αεροπορία σε περίπτωση που η καριέρα του δεν αναγεννιόταν. Η πρώτη ταινία που γύρισε ήταν το κλασσική πλέον Μια υπέροχη ζωή του Κάπρα. Μια ανεξάρτητη παραγωγή της νεοϊδρυθείσας εταιρίας του Κάπρα Liberty Films, που δεν κατάφερε να προσελκύσει κόσμο στους κινηματογράφους και θεωρήθηκε αποτυχημένη. Παρόλα αυτά η ταινία προτάθηκε για πέντε όσκαρ με τον Στιούαρτ ξανά στη λίστα των υποψηφίων. Το Όσκαρ εκείνη τη χρονιά όμως πήγε στον Φρέντρικ Μαρτς για την ταινία Τα καλύτερα χρόνια της ζωής μας.
Ο Κάπρα αναγκάστηκε να κλείσει την εταιρία του κι ο Στιούαρτ άρχισε να αμφισβητεί τις υποκριτικές του δυνατότητες.
Μετά από ένα σύντομο διάλειμμα επέστρεψε το 1947 με την ταινία Πόλις δίχως προσωπείον (Magic town) που δεν έλαβε καλές κριτικές. Το 1948 τον βρήκε να συνεργάζεται για πρώτη φορά με τον Άλφρεντ Χίτσκοκ για την ταινία Η θηλιά, αλλά ούτε αυτή η ταινία έλαβε θετική υποδοχή και μετά από μια σειρά αποτυχημένων προσπαθειών ο Στιούαρτ αποφάσισε να επιστρέψει στο θέατρο, όπου ανέλαβε τον πρωταγωνιστικό ρόλο στην κωμωδία της Μαίρη Τσέις Χάρβεϊ.
Το θεατρικό μεταφέρθηκε στην μεγάλη οθόνη το 1950, από τη Universal. Η πρώτη επιλογή για το ρόλο του Έλγουντ Π. Ντοντ ήταν ο Μπινγκ Κρόσμπι, ο οποίος τον απέρριψε αφήνοντας ελεύθερο το πεδίο για τον Στιούαρτ που πήρε τη θέση του αναγεννώντας έτσι την καριέρα του. Η ταινία ήταν μεγάλη επιτυχία και ξανάφερε τον ηθοποιό στο προσκήνιο και στις υποψηφιότητες για όσκαρ, το οποίο έχασε από τον Χοσέ Φερέρ. Την ίδια χρονιά εμφανίστηκε και στην ταινία Η καραμπίνα φάντασμα (Winchester '73) του Άντονι Μαν με τον οποίο ξεκίνησε μια μακρά περίοδο συνεργασίας. Η συμμετοχή του στην ταινία αυτή της Universal χαρακτηρίστηκε από το γεγονός ότι η αμοιβή του του δόθηκε με ποσοστά από τις εισπράξεις. Η επιτυχία είχε επιστρέψει για τον Στιούαρτ.

Την περίοδο της θητείας του στο Μπρόντγουεϊ με την παράσταση Χάρβεϊ, ο Στιούαρτ παντρεύτηκε τη Γκλόρια Χέιτρικ Μακ Λιν με την οποία απέκτησε δυο δίδυμες κόρες το 1951 και υιοθέτησε δύο αγόρια. Οι δυο τους έμειναν παντρεμένοι μέχρι και το θάνατο της συζύγου το 1994.
Ο Άλφρεντ Χίτσκοκ κι ο Τζέιμς Στιούαρτ συνεργάστηκαν τέσσερις φορές. Η πρώτη τους συνεργασία για την ταινία Η θηλιά δεν είχε θεωρηθεί επιτυχημένη. Η υπόθεση της ταινίας ήταν πολύ προοδευτική για το κοινό του 1948 και ο εμφανής πειραματισμός του Χίτσκοκ (που προσπάθησε να δοκιμάσει να τη γυρίσει αποσπώντας μακρές λήψεις) δεν έλαβε ανταπόκριση. Η δεύτερή τους συνεργασία το 1954 όμως ήταν θριαμβευτική. Η ταινία Σιωπηλός μάρτυς (Rear Window) όπου ο ηθοποιός συμπρωταγωνιστούσε με τη Γκρέις Κέλι θεωρήθηκε αριστούργημα και προτάθηκε για όσκαρ καλύτερης ταινίας, ενώ ο Στιούαρτ θεωρήθηκε ο πιο εμπορικός σταρ της χρονιάς. Το 1956 συνεργάστηκαν πάλι για το ριμέικ μιας παλιότερης ταινίας του ίδιου του Χίτσκοκ Ο άνθρωπος που ήξερε πολλά (A man who knew too much) και το 1958 έλαβε χώρα η τέταρτη και τελευταία τους συνεργασία για την ταινία Δεσμώτης του ιλίγγου (Vertigo). Το Δεσμώτης του ιλίγγου με συμπρωταγωνίστρια την Κιμ Νόβακ θεωρήθηκε αποτυχία κι ο Χίτσκοκ απέδωσε την ευθύνη στην ηλικία του Στιούαρτ.
Στις μέρες μας ο Δεσμώτης του ιλίγγου θεωρείται από πολλούς η καλύτερη ταινία του μετρ του σασπένς.

Πέρα από τη συνεργασία του με τον Χίτσκοκ, ο Στιούαρτ τη δεκαετία του 50 συνεργάστηκε ως επί το πλείστον με το σκηνοθέτη Άντονι Μαν. Η συνεργασία τους σε μια σειρά από θρυλικά γουέστερν με αφετηρία το Η καραμπίνα φάντασμα του 1950, ήταν ιδιαίτερα επιτυχημένη.
Ειδική μνεία πρέπει να γίνει στις ταινίες Το ατελείωτο ρομάντζο (The Glenn Miller Story, 1953) και Η καταραμένη κοιλάδα (The Man From Laramee, 1955) που είναι ίσως οι καλύτερες της συνεργασίας μεταξύ Μαν και Στιούαρτ.
Το 1959 ο Τζέιμς Στιούαρτ συνεργάστηκε με τον Ότο Πρέμιγκερ για την ταινία Ανατομία ενός εγκλήματος (Anatomy Of A Murder) που του απέφερε την πέμπτη και τελευταία υποψηφιότητα για όσκαρ Α' ανδρικού ρόλου, το οποίο έχασε από τον Τσάρλτον Ίστον για το Μπεν Χουρ. Ενώ την επόμενη χρονιά ξεκίνησε τη συνεργασία του με το θρυλικό σκηνοθέτη και μετρ του γουέστερν Τζον Φορντ. Ταινίες όπως οι: Δυο ιππότες της κολάσεως (Two Rode Together, 1960), Ο άνθρωπος που σκότωσε τον Λίμπερτι Βάλανς (The Man Who Shot Liberty Valance, 1962), Η κατάκτηση της δύσης (How The West Was Won, 1962) και Το δειλινό της μεγάλης σφαγής (Cheyenne Autumn, 1964) θεωρούνται κλασσικά αριστουργήματα.
Το 1965 συμμετείχε στην ταινία Το πέταγμα του φοίνικα (The Flight Of The Phoenix) του Ρόμπερτ Όλντριτς, ενώ προς τα τέλη της δεκαετίας του 60, με την αλλαγή των κινηματογραφικών δεδομένων έκανε πέρασμα από την τηλεόραση.

Μετά την αποτυχία της ταινίας The Magic Of Lassie αποσύρθηκε από τον κόσμο της έβδομης τέχνης.
Η απόσυρσή του βέβαια δεν ήταν ολοκληρωτική, καθώς επέστρεφε για ειδικές περιπτώσεις όπως εκείνης του 1983 που συνεργάστηκε με τη Μπέτι Ντέιβις στην τηλεταινία Right Of Way. Οι επενδύσεις που είχε κάνει κατά τη διάρκεια της πολύχρονης καριέρας του, του είχαν αποφέρει πολλά κέρδη κι ήταν πλέον εκατομμυριούχος.
Το 1982 απεβίωσαν οι φίλοι του Χένρι Φόντα και Γκρέις Κέλι. Το 1980 το ινστιτούτο του αμερικανικού κινηματογράφου του απένειμε τιμητικό βραβείο καριέρας και το 1985 του απένειμαν τιμητικό βραβείο Όσκαρ. Τρία χρόνια αργότερα το 1988 χρειάστηκε να σταθεί μπροστά σε μέλη του Κογκρέσου, μαζί με άλλους συναδέλφους του όπως η Κάθριν Χέπμπορν και ο Μπαρτ Λάνκαστερ για να ζητήσει να απαγορευτεί ο χρωματισμός παλιών ασπρόμαυρων ταινιών από την εταιρία του Τεντ Τέρνερ.

Το 1994 απεβίωσε η σύζυγός του από καρκίνο και το 1997 έφυγε και ο ίδιος από πνευμονική εμβολή.